Rede neural para previsão de velocidade de produção enzimática da ampicilina

The antibiotics correspond to the largest production network of the pharmaceutical industry used in human and veterinary medicine, mainly in poultry and swine farming. The enzymatic production of antibiotics is complex and non-linear. Therefore, its modelling owns rate equations with a large number of parameters. In this context, neural networks emerge as an alternative to conventional kinetic models. It is a computational tool that presents mathematical models inspired by human neurons, which allows, after training, to assist in the study and improvement of production data. The application of neural networks in biotechnological processes has been used for years, in order to estimate state variables, to determine biological phases, and to monitor biochemical reactors. The present study utilized the neural network methodology to obtain a kinetic model for the enzymatic synthesis of ampicillin from phenylglycine methyl ester and 6-aminopenicillanic acid catalyzed by penicillin G acylase, immobilized on chitosan. The methodology for the training and simulation of the neural network used in this study began with obtaining a database of antibiotic production rates (Ampicillin), hydrolysis of the reagent and the product. The database was assembled in pairs of concentration and velocity data to form a matrix of training, simulation and validation. Commands in Silab were used to shape the neural network. The number of hidden layers, the number of neurons and the mathematical model were defined for the training, simulation and validation of the neural network. Different transfer functions were tested and the Pureling function proved to be the less precise. Multiple training sessions were accomplished, changing its parameters, in order to obtain the best combination to predict the rate of antibiotic production. The transfer function Tansig, with 100 neurons in the hidden layer, provided the configuration that obtained the best results, in regards to the errors.Os antibióticos correspondem a maior rede de produção da indústria farmacêutica utilizados na medicina humana e veterinária, principalmente na avicultura e na suinocultura. A produção enzimática de antibióticos é complexa e não linear. Consequentemente, sua modelagem possui equações de velocidade com grande número de parâmetros. Nesse contexto, as redes neurais surgem como uma alternativa aos modelos cinéticos convencionais. Trata-se de uma ferramenta computacional que apresenta modelos matemáticos inspirados nos neurônios humanos, o que permite, após treinamento, auxíliar no estudo e aprimoramento dos dados de produção. A aplicação de redes neurais em processos biotecnológicos vem sido utilizada por anos, podendo ser utilizada para estimar variáveis de estado, determinar fases biológicas, monitorar reatores bioquímicos. Este trabalho utilizou a metodologia de rede neural para obter modelo cinético para a síntese enzimática de ampicilina a partir de éster metílico de fenilglicina e ácido 6-aminopenicilânico catalisada por penicilina G acilase imobilizada em quitosana. A metodologia para o treinamento e simulação da rede neural usada neste trabalho iniciou-se com a obtenção de uma base de dados de velocidades de produção do antibiótico (Ampicilina), de hidrólises do reagente e do produto. A base de dados foi montada em pares de dados de concentração e velocidade para formação da matriz de treinamento, simulação e validação. Para modelar a rede neural foram utilizados comandos no Silab. O número de camadas ocultas, o número de neurônios e o modelo matemático foram definidos para a realização do treinamento, simulação e validação da rede neural. Foram testadas diferentes funções de transferência e a função Pureling mostrou-se a menos precisa. Foram realizados múltiplos treinamentos mudando os seus parâmetros com o objetivo de se obter a melhor combinação de forma a prever a velocidade de produção do antibiótico. A configuração que obteve os melhores resultados em relação aos erros foi usando a função transferência tansig e com 100 neurônios na camada oculta

Quorum sensing na prática clínica: mito ou realidade

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências FarmacêuticasEste trabalho tem como objetivo analisar, através desta revisão bibliográfica, a possibilidade de se estudar mais detalhadamente o fenómeno de QS e avaliar a hipótese de se utilizar este mecanismo a favor do tratamento de algumas patologias. A influência dos microrganismos na saúde e/ou enfermidade da população, é uma questão incontornável. É de facto relevante que se efetuem estudos acerca do modo como estes seres sobrevivem, como comunicam entre si e, principalmente, averiguar quais as suas potencialidades para que futuramente possam ser exploradas em proveito da saúde humana. O estudo do QS, suas moléculas sinalizadoras e inibitórias é bastante complexo, devido à elevada quantidade e diversidade de moléculas envolvidas no processo. Este fenómeno permite aos microrganismos, mais especificamente às bactérias, a sobrevivência em comunidade e em condições pouco favoráveis, uma vez que possibilita a formação de uma estrutura designada por biofilme. Esta confere-lhes proteção contra as defesas do hospedeiro e contra os antibióticos. Assim, o estabelecimento de uma infeção torna-se rápido e eficaz. Esta situação é relativamente comum em pacientes com fibrose cística, transplantados, com feridas crónicas, com próteses ortopédicas ou outros dispositivos médicos (cateteres, válvulas, etc). A instalação do biofilme acarreta, para além dos custos económicos devido à repetição dos tratamentos, custos para o doente, nomeadamente, diminuição da qualidade de vida. O sucesso da sobrevivência das bactérias sob a influência do mecanismo de QS, levou os investigadores a colocarem a hipótese de utilizarem este processo nas mais diversas áreas, designadamente na área da saúde. Assim, graças à engenharia genética que permite adicionar ou remover genes de interesse às bactérias e colocá-las sob o controlo de outras através do QS, verificou-se que moléculas sinalizadoras e inibitórias tinham um grande potencial para a deteção e/ou tratamento de alguns tipos de cancro, impediam a formação de biofilmes sobre as superfícies das próteses, permitiam identificar os agentes etiológicos de determinadas infeções, constituíam uma excelente alternativa terapêutica no tratamento de feridas crónicas, entre outros. É neste contexto que se compreende a relevância do estudo e compreensão do QS, para que seja possível utilizá-lo na prática clínica, motivo pelo qual se efetuam inúmeras investigações, que até à data revelaram resultados bastante promissores. This work aims to analyze, through this literature review, the possibility of studying in detail the phenomenon of QS in order to identify potential ways of disruption and evaluate the possibility of using this mechanism in favor of the treatment of some diseases. The influence of microorganisms in health and / or illness of the population, is an unavoidable question. It is indeed important to be made, any studies about how these organisms survive, how they communicate with each other, and especially to ascertain what their potential future so that they can be exploited for the human health benefit. Study of QS signaling molecules and their inhibitory is quite complex, due to the high number and diversity of molecules involved in the process. This phenomenon allows micro-organisms, more particularly bacteria, to survival in community under undesirable conditions, since it enables the formation of a structure that provides protection against host defenses and against antibiotics, called biofilm. Thus, the establishment of an infection becomes faster and more effective. This situation is relatively common in patients with cystic fibrosis, transplant recipients, patients with chronic wounds or patients with orthopedic or other medical devices (catheters, valves, etc.). The installation of biofilm brings, apart from the economic costs due to repeated treatments, costs to the patient, in particular, decreased of life’s quality. The success of the bacteria’s survival under the influence of QS mechanism, led investigators to consider the hypothesis to use this process in several areas, particularly in health. Thus, by genetic engineering which enables adding or removing bacteria interesting genes and placed them under control of other bacteria, by QS was found that both inhibitory and signaling molecules have a great potential for the detection and / or treatment of some types of cancer, prevented the formation of biofilms on the surfaces of prostheses, allowed to identify the etiologic agents of certain infections and were an excellent therapeutic option in the treatment of chronic wounds. It is in this context, lies the importance of studying and understanding the QS, so you can use it in clinical practice, which is why numerous investigations are carried out, which to date have shown very promising results

Quorum Sensing na Prática Clínica: mito ou realidade

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências FarmacêuticasEste trabalho tem como objetivo analisar, através desta revisão bibliográfica, a possibilidade de se estudar mais detalhadamente o fenómeno de QS e avaliar a hipótese de se utilizar este mecanismo a favor do tratamento de algumas patologias. A influência dos microrganismos na saúde e/ou enfermidade da população, é uma questão incontornável. É de facto relevante que se efetuem estudos acerca do modo como estes seres sobrevivem, como comunicam entre si e, principalmente, averiguar quais as suas potencialidades para que futuramente possam ser exploradas em proveito da saúde humana. O estudo do QS, suas moléculas sinalizadoras e inibitórias é bastante complexo, devido à elevada quantidade e diversidade de moléculas envolvidas no processo. Este fenómeno permite aos microrganismos, mais especificamente às bactérias, a sobrevivência em comunidade e em condições pouco favoráveis, uma vez que possibilita a formação de uma estrutura designada por biofilme. Esta confere-lhes proteção contra as defesas do hospedeiro e contra os antibióticos. Assim, o estabelecimento de uma infeção torna-se rápido e eficaz. Esta situação é relativamente comum em pacientes com fibrose cística, transplantados, com feridas crónicas, com próteses ortopédicas ou outros dispositivos médicos (cateteres, válvulas, etc). A instalação do biofilme acarreta, para além dos custos económicos devido à repetição dos tratamentos, custos para o doente, nomeadamente, diminuição da qualidade de vida. O sucesso da sobrevivência das bactérias sob a influência do mecanismo de QS, levou os investigadores a colocarem a hipótese de utilizarem este processo nas mais diversas áreas, designadamente na área da saúde. Assim, graças à engenharia genética que permite adicionar ou remover genes de interesse às bactérias e colocá-las sob o controlo de outras através do QS, verificou-se que moléculas sinalizadoras e inibitórias tinham um grande potencial para a deteção e/ou tratamento de alguns tipos de cancro, impediam a formação de biofilmes sobre as superfícies das próteses, permitiam identificar os agentes etiológicos de determinadas infeções, constituíam uma excelente alternativa terapêutica no tratamento de feridas crónicas, entre outros. É neste contexto que se compreende a relevância do estudo e compreensão do QS, para que seja possível utilizá-lo na prática clínica, motivo pelo qual se efetuam inúmeras investigações, que até à data revelaram resultados bastante promissores. This work aims to analyze, through this literature review, the possibility of studying in detail the phenomenon of QS in order to identify potential ways of disruption and evaluate the possibility of using this mechanism in favor of the treatment of some diseases. The influence of microorganisms in health and / or illness of the population, is an unavoidable question. It is indeed important to be made, any studies about how these organisms survive, how they communicate with each other, and especially to ascertain what their potential future so that they can be exploited for the human health benefit. Study of QS signaling molecules and their inhibitory is quite complex, due to the high number and diversity of molecules involved in the process. This phenomenon allows micro-organisms, more particularly bacteria, to survival in community under undesirable conditions, since it enables the formation of a structure that provides protection against host defenses and against antibiotics, called biofilm. Thus, the establishment of an infection becomes faster and more effective. This situation is relatively common in patients with cystic fibrosis, transplant recipients, patients with chronic wounds or patients with orthopedic or other medical devices (catheters, valves, etc.). The installation of biofilm brings, apart from the economic costs due to repeated treatments, costs to the patient, in particular, decreased of life’s quality. The success of the bacteria’s survival under the influence of QS mechanism, led investigators to consider the hypothesis to use this process in several areas, particularly in health. Thus, by genetic engineering which enables adding or removing bacteria interesting genes and placed them under control of other bacteria, by QS was found that both inhibitory and signaling molecules have a great potential for the detection and / or treatment of some types of cancer, prevented the formation of biofilms on the surfaces of prostheses, allowed to identify the etiologic agents of certain infections and were an excellent therapeutic option in the treatment of chronic wounds. It is in this context, lies the importance of studying and understanding the QS, so you can use it in clinical practice, which is why numerous investigations are carried out, which to date have shown very promising results

APLICAÇÃO DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR NA ANÁLISE QUALITATIVA DE AMOXICILINA FORA DO PRAZO DE VALIDADE

This study presents a qualitative analysis of the drug Amoxicilxin suspension 250mg/ 5ml, using the Nuclear Magnetic Resonance (NMR) method. The signs of ¹H-NMR and ¹³C-NMR of an amoxicilline pattern with expired drugs (3 years) and on shelf life were compared, and changes in signals referring to the amoxicilline molecule were observed. The drugs did not undergo any previous treatment for analysis and were only dissolved in dimethylsulxide (DMSO-d6) for the experiments and were carried out with the same parameters of adjustment of the equipment. To compare the signs, the spectra were overlaped, and no absence of any of the signs related to the drug was observed. The use of comparison of the signs was very intuitive and easy to interpret and no significant differences were observed in the signs of the drug in both drugs, valid and expired.  Este estudio presenta un análisis cualitativo del fármaco Amoxicixina suspensión 250mg/5ml, utilizando el método de Resonancia Magnética Nuclear (RMN). Se compararon los signos de ¹H-RMN y ¹³C-RMN de un patrón de amoxicilina con fármacos caducados (3 años) y en vida útil, y se observaron cambios en las señales referidas a la molécula de amoxicilina. Los fármacos no se sometieron a ningún tratamiento previo para su análisis y solo se disolvieron en dimetilsulxuro (DMSO-d6) para los experimentos y se realizaron con los mismos parámetros de ajuste del equipo. Para comparar los signos, los espectros se superpusieron y no se observó la ausencia de ninguno de los signos relacionados con el fármaco. El uso de la comparación de los signos fue muy intuitivo y fácil de interpretar y no se observaron diferencias significativas en los signos del fármaco en ambos fármacos, válidos y caducados.Este estudo apresenta uma análise qualitativa do medicamento Amoxicilina suspensão 250mg/ 5ml, utilizando o método de Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Foram comparados os sinais de ¹H-RMN e ¹³C-RMN de um padrão de amoxicilina com medicamentos vencidos (3 anos) e no prazo de validade sendo observadas mudanças dos sinais referentes a molécula de amoxicilina. Os medicamentos não sofreram nenhum tratamento prévio para análise sendo apenas dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO-d6) para a realização dos experimentos e foram realizados com os mesmos parâmetros de ajuste do equipamento. Para comparação dos sinais foi realizada a sobreposição dos espectros não sendo observada ausência de nenhum dos sinais referentes ao fármaco. A utilização de comparação dos sinais mostrou-se bastante intuitiva e de fácil interpretação e não foram observadas diferenças significativas nos sinais do fármaco em ambos os medicamentos, válido e vencido

Aminólise enantiosseletiva do (R,S)-mandelato de metila e síntese do acetato de geranoíla mediada por lipases

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química

Imobilização da lipase de Pseudomonas fluorescens em suportes à base de quitosana e amido polialdeídico para utilização em biocatálise

Orientadora: Profa. Dra. Nadia KriegerDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Exatas, Programa de Pós-Graduação em Química. Defesa : Curitiba, 25/01/2021Inclui referências: p. 88-97Resumo: Este trabalho teve como objetivo imobilizar a lipase comercial de Pseudomonas fluorescens em suportes à base de quitosana (QTS) e amido polialdeídico (AP) e a aplicação dos derivados imobilizados em biocatálise. Inicialmente, a quitosana em pó foi gelificada em uma solução de ácido acético 2,5% (v v-1) e convertida em esferas através da precipitação por gotejamento em solução de NaOH e etanol. Após a filtração e secagem, as esferas foram modificadas com glutaraldeído (GA) (3% v v-1) e com amido polialdeídico com diferentes teores aldeídicos (0,77 - 8,0 mmol g-1). O amido polialdeídico foi obtido através da oxidação seletiva do amido de milho com periodato de sódio. Foram obtidos os suportes, quitosana derivatizada com glutaraldeído (QTS/GA) e com amido polialdeídico (QTS/AP). Estes suportes foram caracterizados por espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), grau de crosslinking, área superficial e distribuição do tamanho do poro. Os suportes QTS/GA e QTS/AP foram utilizados para imobilizar a lipase, resultando nos derivados QTS/GA/LAK e QTS/AP(I-V)/LAK. Foram investigados os principais parâmetros do processo de imobilização: eficiência de imobilização (E), retenção de atividade (R) e atividade de hidrólise em meio orgânico. As eficiências de imobilização foram 59% para QTS, 85% para QTS/GA e 98% para QTS/APV, em apenas 5 h. A lipase imobilizada em QTS/GA e QTS/APIII manteve 95% de sua atividade residual após incubação a 50 °C; a 70 °C, a atividade foi mantida em 60% para QTS/GA/LAK e em 74% para QTS/APIII/LAK, após incubação de 8 h em n-hexano. QTS/APIII/LAK também se mostrou estável em isooctano (log P 4,35), n-heptano (log P 4,0) e n-hexano (log P 3,5), mantendo mais de 80% de sua atividade após 8 h de incubação a 35 °C. As atividades de hidrólise contra tricaprilina em n-hexano para LAK imobilizada em QTS, QTS/GA/LAK e QTS/APIII/LAK foram de 5 U g-1, 153 U g-1 e 156 U g-1, respectivamente. Entre os três preparados enzimáticos avaliados, as atividades de esterificação foram de 3,2 U g- 1, 44 U g-1 e 124 U g-1, respectivamente, na síntese de oleato de etila em n-hexano, com 5%, 47% e 72% de conversão em 6 h, a 40 °C. QTS/GA/LAK e QTS/APIII/LAK foram utilizados para catalisar reações em sistemas livres de solvente, na síntese do cinamato de etila, um éster de aroma, obtendo-se conversões de 59% e 83%, respectivamente, em 40 h, a 50 °C. Os derivados imobilizados QTS/GA/LAK e QTS/APIII/LAK foram utilizados na resolução cinética dos álcoois (RS)-1-feniletanol e (RS)-1-fenilpropanol por reações de transesterificação com acetato de vinila. Foram obtidos excelentes valores de excesso enantiomérico (ee >95%) e coeficiente de enantiosseletividade (E > 200) para os isômeros (R) de ambos os substratos avaliados. Os resultados reportados neste trabalho são promissores, complementam a literatura e fundamentam estudos futuros para o desenvolvimento de aplicações da quitosana e do amido polialdeídico em biocatálise.Abstract: This work aimed to immobilize the commercial lipase of Pseudomonas fluorescens on supports based on chitosan (CHT) and polyaldehyde starch (PS) and the application of immobilized derivatives in biocatalysis. Initially, the chitosan powder was gelled in a 2.5% acetic acid solution (v v-1) and converted into spheres through drip precipitation in NaOH and ethanol solution. After filtration and drying, the spheres were modified with glutaraldehyde (GA) (3% v v-1) and with polyaldehyde starch with different aldehyde levels (0.77 - 8.0 mmol g-1). Polyaldehyde starch was obtained through the selective oxidation of corn starch with sodium periodate. The obtained supports were, chitosan derivatized with glutaraldehyde (CHT/GA) and with polyaldehyde starch (CHT/PS). These supports were characterized by Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), degree of crosslinking, surface area and pore size distribution. The CHT/GA and CHT/PS supports were used to immobilize the lipase, resulting in the CHT/GA/LAK and CHT/PS(I-V)/LAK derivatives. The main parameters of the immobilization process were investigated: immobilization efficiency (E), activity retention (R) and hydrolysis activity in organic medium. Immobilization efficiencies were 59% for CHT, 85% for CHT/GA and 98% for CHT/PSV, in just 5 h. The lipase immobilized in CHT/GA and CHT/PSIII maintained 95% of its residual activity after incubation at 50 °C; at 70 °C, the activity was maintained at 60% for CHT/GA/LAK and at 74% for CHT/APIII/LAK, after 8 h incubation in n-hexane. CHT/PSIII/LAK was also stable in isooctane (log P 4.35), n-heptane (log P 4.0) and n-hexane (log P 3.5), maintaining more than 80% of its activity after 8 h incubation at 35 °C. For LAK immobilized in CHT, CHT/GA and CHT/APIII the hydrolysis activities against tricapriline in hexane were 5 U g-1, 153 U g-1 and 156 U g-1, respectively. Among the three enzyme preparations evaluated, the esterification activities were 3.2 U g-1, 44 U g-1 and 124 U g-1, respectively, in the synthesis of ethyl oleate in n-hexane, with 5%, 47% and 72% conversion in 6 h at 40 °C. The derivatives CHT/GA/LAK and CHT/APIII/LAK were used to catalyze reactions in solvent-free systems, in the synthesis of ethyl cinnamate, an aroma ester, obtaining conversions of 59% and 83%, respectively, in 40 h at 50 °C. The immobilized derivatives CHT/GA/LAK and CHT/APIII/LAK were used in the kinetic resolution of alcohols (RS)-1- phenylethanol and (RS)-1-phenylpropanol via transesterification reactions with vinyl acetate. Excellent values of enantiomeric excess (ee> 95%) and enantioselectivity coefficient (E> 200) for the (R) isomers of both evaluated substrates were obtained. The results reported in this work are promising, complement the literature and support future studies for the development of applications of chitosan and polyaldehyde starch in biocatalysis

APLICAÇÃO DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR NA ANÁLISE QUALITATIVA DE AMOXICILINA FORA DO PRAZO DE VALIDADE

This study presents a qualitative analysis of the drug Amoxicilxin suspension 250mg/ 5ml, using the Nuclear Magnetic Resonance (NMR) method. The signs of ¹H-NMR and ¹³C-NMR of an amoxicilline pattern with expired drugs (3 years) and on shelf life were compared, and changes in signals referring to the amoxicilline molecule were observed. The drugs did not undergo any previous treatment for analysis and were only dissolved in dimethylsulxide (DMSO-d6) for the experiments and were carried out with the same parameters of adjustment of the equipment. To compare the signs, the spectra were overlaped, and no absence of any of the signs related to the drug was observed. The use of comparison of the signs was very intuitive and easy to interpret and no significant differences were observed in the signs of the drug in both drugs, valid and expired.  Este estudio presenta un análisis cualitativo del fármaco Amoxicixina suspensión 250mg/5ml, utilizando el método de Resonancia Magnética Nuclear (RMN). Se compararon los signos de ¹H-RMN y ¹³C-RMN de un patrón de amoxicilina con fármacos caducados (3 años) y en vida útil, y se observaron cambios en las señales referidas a la molécula de amoxicilina. Los fármacos no se sometieron a ningún tratamiento previo para su análisis y solo se disolvieron en dimetilsulxuro (DMSO-d6) para los experimentos y se realizaron con los mismos parámetros de ajuste del equipo. Para comparar los signos, los espectros se superpusieron y no se observó la ausencia de ninguno de los signos relacionados con el fármaco. El uso de la comparación de los signos fue muy intuitivo y fácil de interpretar y no se observaron diferencias significativas en los signos del fármaco en ambos fármacos, válidos y caducados.Este estudo apresenta uma análise qualitativa do medicamento Amoxicilina suspensão 250mg/ 5ml, utilizando o método de Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Foram comparados os sinais de ¹H-RMN e ¹³C-RMN de um padrão de amoxicilina com medicamentos vencidos (3 anos) e no prazo de validade sendo observadas mudanças dos sinais referentes a molécula de amoxicilina. Os medicamentos não sofreram nenhum tratamento prévio para análise sendo apenas dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO-d6) para a realização dos experimentos e foram realizados com os mesmos parâmetros de ajuste do equipamento. Para comparação dos sinais foi realizada a sobreposição dos espectros não sendo observada ausência de nenhum dos sinais referentes ao fármaco. A utilização de comparação dos sinais mostrou-se bastante intuitiva e de fácil interpretação e não foram observadas diferenças significativas nos sinais do fármaco em ambos os medicamentos, válido e vencido

Sistemas de duas fases aquosas ambientalmente sustentáveis para a purificação de DNA plasmídico

Dissertação de mestrado em Bioquímica AplicadaOs sistemas de duas fases aquosas (SDFA’s) oferecem um grande potencial para a purificação em grande escala de DNA plasmídico (pDNA) para posterior aplicação em terapias moleculares. Estes sistemas baseiam-se na mistura de dois polímeros ou de um polímero e um sal em água, que acima de concentrações críticas formam duas fases distintas que possibilitam a partição diferencial dos compostos adicionados. Considerando as diversas vantagens, que incluem a facilidade de aumento de escala e o baixo custo, destaca-se a operação em contínuo (em macro e microescala) e a elevada capacidade. Neste trabalho, estudou-se a possibilidade de utilização de sistemas de duas fases aquosas ambientalmente sustentáveis para a purificação de pDNA. Testaram-se sistemas polímero-sal e líquido iónico-sal. Foi caracterizado o sistema PEG-citrato de sódio. E observou-se que as curvas binodais obtidas são semelhantes às de outros sistemas PEG-sal bem previamente descritos. A caracterização do sistema permitiu concluir que o efeito de “salting-out” do citrato é fator determinante para a formação e separação das fases. Os estudos de partição e purificação das moléculas de pDNA, presentes no lisado alcalino, permitiram selecionar os sistemas 23% (p/p) citrato de sódio, 20% (p/p) PEG 400 a pH 6,9 e 16% (p/p) citrato de potássio, 36% (p/p) brometo de 1-butil-3-metilimidazólio para posterior purificação num processo multi-estágio. Nestes sistemas, registou-se a acumulação de moléculas de RNA na fase superior. As moléculas de pDNA apresentaram distribuição na fase inferior rica em sal. Apesar de se ter registado a presença de RNA na fase superior destes sistemas, ainda permaneceram moléculas de acido ribonucleico na fase inferior onde também se distribuem as moléculas de plasmídeo. Assim, procedeu-se ao uso de vários estágios para remover a totalidade das moléculas de RNA e dos contaminantes proteicos. Utilizando este processo de multi-estágio obteve-se plasmídeo com elevado grau de pureza na fase inferior. Estes dois sistemas apresentam assim um grande potencial para futura purificação de pDNA em contínuo.Aqueous two-phase systems (ATPS's) offer a great potential for large scale purification of plasmid DNA (pDNA) for subsequent use in molecular therapies. These systems are based on the mixture in water of two polymers or a polymer and a salt - which above critical concentrations form two phases. This allow the differential partition of compounds between the two phases. These systems presents several advantages that includes easy scale-up, low cost, possibility of continuous operation (at macro and micro scale) and high capacity. In this work it was studied the possibility of using environmental friendly aqueous twophase systems for purifying pDNA. The systems tested were polymer-salt and ionic liquid-salt. The system PEG-sodium citrate was characterized and it was observed that binodal curves obtained were similar to other PEG-salt systems previously described. From the characterization of these systems it was concluded that the effect of "salting -out" of citrate is determinant for the formation and separation of the phases. Partition and purification studies of pDNA molecules, present in the alkaline lysate, allowed the selection of the systems 23% (w/w) sodium citrate, 20% (w/w) PEG 400 at pH 6,9 and 16% (w/w) potassium citrate, 36% (w/w) 1-butyl-3-methylimidazolium bromide for further purification in multi-stage process. In these systems, RNA molecules partitioned to the top phase, while plasmid DNA molecules were distributed in the salt-rich bottom phase. Although it was detected the presence of RNA in the top phase of these systems, some ribonucleic acid molecules remained in the bottom phase. Thus, we proceeded to use several stages to remove all of the RNA molecules and protein contaminants. Using this multi-stage process plasmid was obtained with high purity in the bottom phase. These two systems present though great potential for future purification of pDNA in continuous mode

ISOLAMENTO DE MUTANTES DE Lactobacillus delbrueckii UFV H2B20 COM TOLERÂNCIA ACENTUADA AO CONGELAMENTO E EFEITO DE SUBSTÂNCIAS CRIOPROTETORAS NA SUA VIABILIDADE DURANTE A ESTOCAGEM

O objetivo deste estudo foi obter estirpes mutantes de L. delbrueckii UFV H2b20 com tolerância acentuada ao congelamento e também avaliar o efeito de substâncias crioprotetoras na sua viabilidade durante a estocagem. A utilização dos crioprotetores sacarose, glutamato monossódico (GMS) e leite desnatado reconstituído a 10 % (LDR) aumentaram a viabilidade de estirpes mutantes durante 15 dias de estocagem a -20 °C em relação ao controle (sem crioprotetor). Os crioprotetores sacarose e LDR 10 % foram efetivos na manutenção da viabilidade da estirpe selvagem durante o período de estocagem. Embora a tolerância ao congelamento tenha sido alcançada, estudos posteriores são necessários para avaliar se outras características que qualificam Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 como probiótico foram afetadas

Utilização de sistemas bifásicos aquosos para purificação de bioprodutos de interesse farmacêutico

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas MonizOs sistemas bifásicos aquosos formam-se devido à incompatibilidade entre duas soluções aquosas, podendo estas ser formandas por dois polímeros ou por um polímero e um sal. A utilização destes sistemas em processos de separação apresenta inúmeras vantagens em comparação com outros métodos de separação e purificação de biomoléculas, sendo assim utilizados como um dos passos da sequência de etapas de extracção/purificação. A elevada quantidade de água, a biocompatibilidade, a sua capacidade de reprodução em larga escala, o baixo custo das matérias-primas utilizados e a possibilidade de reutilizar os polímeros e sais são algumas das vantagens que o fazem ser alvo de estudo em inúmeras aplicações, tanto no ramo alimentar, como no ramo da indústria farmacêutica. Esta dissertação aborda as aplicações onde estes podem ser utilizados no que diz respeito aos produtos de interesse farmacêutico, tais como antibióticos, anticorpos monoclonais, proteínas, entre outros. É feita uma revisão dos métodos já existentes, comparando-os de forma a proporcionar uma perspectiva global do que já foi conquistado pela investigação e pretende-se aferir se esta técnica poderá ser um método viável para a obtenção de biomoléculas em larga escala de forma eficiente, segura, económica e ecológica